Световая микроскопия
Большим достижением в развитии методов визуализации микробных клеток стало изобретение Цернике (Zernike) в 1934 г. фазово-контрастного микроскопа, и разработка этого вида микроскопии Кёллером и Лузом (Loos). При обычной световой микроскопии контраст достигается в том случае, если различные структурные элементы по-разному поглощают свет. Такой тип образца называют абсорбционным или амплитудным объектом, поскольку он меняет амплитуду падающего света.
Другие объекты, в том числе многие бактерии, относятся к фазовому типу они совсем не поглощают свет или все части объекта поглощают его одинаково. В структуре таких образцов имеются различия по толщине или показателю преломления, и поэтому они изменяют только фазу волны падающего света, но не амплитуду. Человеческий глаз не способен уловить эти фазовые сдвиги. Метод фазового контраста позволяет сделать объекты видимыми путем превращения фазовых сдвигов в амплитудные (различия в яркости). Это превращение происходит благодаря интерференции, обусловленной свойствами объекта (рис.1, A).
Другим методом визуализации микробных клеток служит интерференционная отражательная микроскопия, основанная на использовании интерференции волн, отраженных от различных границ раздела фаз, например, стекло-вода и вода-плазмалемма. Благодаря изменениям коэффициента преломления возникает псевдотрехмерное изображение, в котором можно количественно определить толщину объекта.
В настоящее время все большее применение находит флуоресцентная эпимикроскопия - микроскопия с использованием специальных приставок для эпиосвещения (освещения через объектив), устанавливаемых на обычный световой микроскоп. Этот метод используют для изучения объектов, которые при облучении светом с длиной волны 420 нм (рис. 1, Б) флуоресцируют сине-зеленым светом, благодаря присутствию в их клетках кофермента F420 (как, например, метаногены). Флуоресценция характерна также для фитопатогенной бактерии Pseudomonas aeruginosa, содержащей голубой пигмент пиоцианин (относится к семейству феназина; наличие служит видовым признаком).
Рис. 1. Микрофотографии клеток прокариот, полученные с помощью методов световой и электронной микроскопии.
А. Клетки Chromatium okenii, заполненные глобулами серы. Световая микроскопия; фазовый контраст. Шкала 10 мкм.
Б. Метаногенная архея Methanospirillum hungatei (флуоресцентная световая микроскопия) при освещении светом длиной волны 420 мкм. Шкала 10 мкм.
В. Две клетки Е. coli в начальной стадии конъюгации, соединенные F-пилями (световая микроскопия с использованием меченного флуорохромом бактериофага MS2, специфичного к F-пилям). Шкала 5 мкм.
Г. Клетки Alcaligenes eutrophus со жгутиками (электронная просвечивающая микроскопия). Шкала 1 мкм.
Д. и Е. Демонстрация присутствия адгезина на поверхности клеток Enterococcus faecalis после индукции половыми феромонами (ультратонкие срезы клеток; электронная микроскопия).
Д. Обработанные полимером клетки с бахромой из тонких фибрилл на поверхности. Шкала 0,1 мкм.
E. Клетки, обработанные антителами к адгезину в комплексе со вторыми антителами. конъюгированными с коллоидным золотом. Адгезин виден как нитевидные структуры между клеточной стенкой и частицами золота. Шкала 0.1 мкм.
Другой способ применения флуоресцентной световой микроскопии основан на добавлении к анализируемым клеткам флуорохромов, одним из которых служит ДАФИ (4,6-диамидинофенилиндол). Этот краситель связывается с двухцепочечной молекулой ДНК, что позволяет визуализировать область локализации ДНК внутри клеток.
Различные виды прокариот можно идентифицировать с помощью флуоресцентно меченных антител (рис.1, В), используя антитела против отдельных клеточных компонентов, например, придатков клеточной стенки или мРНК.
Степень разрешения световой микроскопии удалось повысить путем разработки метода лазерной конфокальной сканирующей микроскопии. В этих приборах вместо обычного источника света используется лазер. Лазерный луч сканирует шаг за шагом поверхность образца, и получаемое изображение создается в результате накопления результатов измерения интенсивности проходящего, отраженного или испускаемого света в каждой точке и их компьютерной обработки. Основанный на специфических свойствах лазерного луча (когерентность), этот метод позволяет получать изображения тонких плоскостей внутри образца и устранять «загрязняющие» изображения соседних областей. Таким образом, объект оптически разделяется на отдельные плоскости, что позволяет получать трехмерную реконструкцию объекта и проводить разнообразные количественные измерения.
Морфологию и ультраструктуру прокариот изучают с помощью световой и электронной микроскопии. Предел разрешения светового микроскопа составляет примерно 0,25 мкм. Электронная микроскопия позволяет выявлять детали на клеточном и макромолекулярном уровнях, давая изображение в масштабе нанометров. Необходимая подготовка биологических образцов для электронной микроскопии часто вызывает появление артефактов.
