Электронная микроскопия
Рис. 1. Макромолекулы‚ визуализированные различными методами электронной микроскопии.
А. Молекула глутаминсинтетазы (просвечивающая электронная микроскопия; негативо контрастированный препарат). Шкала 50 нм.
Б. Клеточная стенка Clostridium aceticum; S-слой и жгутик, образованный спирально расположенными молекулами флагеллина (сканирующая электронная микроскопия; препарат, приготовленный методом замораживания - скалывания. Шкала 50 нм.
В. Плазмида pBR322; ковалентно замкнутая (I) и незамкнутая (I I) формы (просвечивающая электронная микроскопия; препарат, окрашенный в процессе центрифугирования в градиенте плотности CSCI). Шкала 0,5 мкм.
Г. Плазмида pBR322 (незамкнутая форма) и связанные с ней молекулы рестриктазы EcoRI в виде тетрамерных частиц (указаны жирными стрелками) и их субъединиц (указаны тонкими стрелками). Препарат приготовлен тем же методом, что и в B. Шкала 0,1 мкм.
Д. Частично денатурированная ДНК бактериофага 16-6-12 из Rhizobium Iupini (препарат контрастирован металлом c двух направлений и окрашен с применением цитохрома с). Стрелками указаны участки разделения цепей. Шкала 0,5 мкм.
Разрешение при световой микроскопии не превышает 0,25 мкм. Увидеть детали строения клеток на молекулярном уровне, т.е. в диапазоне нанометров, позволяет электронная микроскопия. Однако она имеет как метод ряд недостатков:
- Во-первых, электронная микроскопия связана с необходимостью обезвоживания образца, которое нередко приводит к возникновению артефактов (и в связи с этим стоит задача совершенствования методов подготовки биологических образцов для электронной микроскопии с уменьшением повреждающих эффектов).
- Во-вторых, во многих случаях толщина микроскопируемого образца слишком велика для прохождения через него электронного луча.
- В-третьих, входящие в состав биологических объектов химические элементы лишь слабо взаимодействуют с формирующим изображение электронным лучом и вследствие этого контраст при микроскопии получается недостаточным.
Уменьшения деформации клеток и потери материала при подготовке образца для микроскопии позволяет достичь химическая фиксация образца, предшествующая обезвоживанию. Вероятность артефактов значительно снижают применяемые в настоящее время техника получения замороженных срезов и методы получения изображения, позволяющие сохранять замороженную воду в образце.
Уменьшения толщины образца можно достичь путем изготовления пропитанных смолами ультратонких срезов химически фиксированных и обезвоженных либо замороженных образцов. Оба способа получения срезов позволяют разрезать прокариотическую клетку среднего диаметра на 20 слоев.
Усиления контраста достигают путем инкубации образца в растворе, содержащем ионы солей тяжелых металлов, - «позитивное» окрашивание ультратонких срезов в результате «оттенения» металлами сухих образцов, размещенных на пленках-подложках, или «негативное» окрашивание, получаемое при выпадении осадка солей тяжелых металлов вокруг объекта. После удаления раствора солей промокательной бумагой остающиеся вокруг объекта соли очерчивают его контуры.
Непрямое изображение объекта можно получить при использовании метода реплик, который позволяет выявить структуру наружной поверхности образца. Внутренние поверхности могут быть выявлены с помощью метода замораживания-скалывания.
Результаты применения методов контрастирования, используемых в электронной микроскопии, показывают распределение тяжелого металла, а не структурные элементы в образце. Недавно предложен метод получения изображения образца, замороженного в водной фазе, который не требует применения металлов, поскольку изображение обеспечивается контрастом между водой и биологическим образцом.
В электронной микроскопии, как и в световой, применяют меченые антитела, обработанные не флуоресцентными метками, а электронно-непрозрачными маркерами, например, коллоидным золотом. Этот подход называют электронно-микроскопической иммуноцитохимией.
Помимо обычной просвечивающей электронной микроскопии с использованием криопроцедур, имеются различные методы сканирования для получения изображения образца на клеточном и макромолекулярном уровнях. Применение метода сканирования требует иных способов подготовки препарата.
